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特应性皮炎（atopic dermatitis，AD）是一种常见的炎症性皮肤疾病，特征为剧烈瘙痒、复发性湿疹样病变和Th2介导的免疫响应。计划性T细胞（Regulatory T cell，Treg）在调控炎症、扼制Th2细胞(T helper 2 cell)和保管免疫稳态中弘扬要津作用。先前的磋议对于AD患者中Treg比例存在突破截止，一些磋议发现Treg比例未改革，而其他磋议则说明Treg数目增多。在过敏性疾病中，Treg对Th2细胞的扼制作用被壅塞以及Th2型炎症的促进背后的精确分子机制尚不明晰。因此，探究AD中Treg数目和功能变化背后的分子机制至关裂缝。

近日，南边医科大学皮肤病病院梁云生课题组探讨了在特应性皮炎（AD）中，Treg数目和功能变化的分子机制，以及这些变化若何影响Th2型炎症。接洽磋议遵守以“IL-4-induced decrease in both the number and CTLA-4 expression of Treg impairs suppression of Th2 type inflammation in severe atopic dermatitis”为题发表在《Journal of Dermatological Science》期刊。深圳易基因科技为本磋议提供靶基因甲基化测序（Target-BS）期间作事。

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磋议通过流式细胞术、mRNA测序（mRNA-seq）、共培养施行、共免疫千里淀、染色质免疫千里淀和亚硫酸盐测序（BS-seq）等依次，在体外或AD小鼠模子以及AD患者中磋议分子机制。分析截止标明在轻度和中度AD中检测到Treg比例增多。而在重度AD患者中，Treg数目和CTLA-4抒发特征性减少则与血清IL-4 (interleukin-4)水平接洽，这与体外高浓度IL-4贬责下的考据分析截止一致。其背后机制是IL-4/pSTAT6通路招募DNMT1和HDAC2来扼制Foxp3和CTLA-4位点的转录调控。高水平的IL-4壅塞了Treg通过CTLA-4介导的Th2细胞分化扼制，而在Treg中阻断IL-4Rα信号收复了AD模子小鼠和AD患者的Treg数目和Th2细胞扼制。

总之，本磋议截止标明，Treg数目及AD患者严重进度分级与血清IL-4水平接洽。相等高水平IL-4表不雅遗传调控Treg数目和CTLA-4抒发减少。IL-4指点Treg上的CTLA-4抒发减少毁伤了Th2细胞分化扼制。

磋议依次

磋议队伍：42名AD患者和14名健康志愿者（(healthy volunteers，HVs），以及用于施行的特定基因敲除小鼠。通过MC903指点AD小鼠模子，评估耳厚度和组织学变化。从东说念主和小鼠样本均诀别和分化细胞，进行Treg扼制施行和流式细胞术分析。使用ELISA和Western blotting期间分析血清和卵白抒发水平。通过亚硫酸盐测序（Target-BS）和共免疫千里淀施行分析DNA甲基化和卵白相互作用。进行染色质免疫千里淀（ChIP）和RT-qPCR分析特定基因位点的表不雅遗传修饰。

截止图形

（1）Treg数目与AD严重进度分级和血清中IL-4水平接洽。IL-4导致重度AD患者的Treg数目和CTLA-4抒发减少。

图1. IL-4水平增多导致重度AD患者中Treg数目和CTLA-4抒发减少。

A. AD患者和健康志愿者（HVs）中Foxp3+ CD25+ Treg（在CD3+ CD4+ T细胞中筛选）的代表性流式细胞术和定量分析。

B. AD患者和HVs的血清IL-4水平。

C. 重度AD患者和年纪性别匹配的健康志愿者外周血中CTLA-4+抒发（在CD3+ CD4+ Foxp3+ CD25+ Treg中筛选）的代表性流式细胞术和定量分析。

D. AD患者中Foxp3+、CTLA-4+抒发与血清IL-4水平之间的接洽性。

E. 培养的Treg中Foxp3+ CD25+ Treg（在CD4+ T细胞中筛选）、CTLA-4+抒发（在CD4+ T细胞中筛选）的代表性流式细胞术和定量分析。

（2）IL-4/pSTAT6信号通路若何通过招募DNA甲基转念酶1（DNMT1）和组卵白去乙酰化酶2（HDAC2）来扼制Foxp3和CTLA-4基因位点的转录调控。

图2. IL-4/pSTAT6通路招募DNMT1和HDAC2来扼制Foxp3和CTLA-4位点的转录调控。从健康志愿者（HV）的外周血单个核细胞（PBMCs）中纯化出运转T细胞，并在体外用IL-2/TGFβ1培养4天，然后有或莫得高浓度IL-4刺激突出3天。

A. 聚类热图披露培养的Treg中转录因子各别抒发，其中深红色示意高基因抒发水平。

B. Western blotting分析TETs、DNMTs和HDACs卵白。

C. Target-BS分析Foxp3和CTLA-4位点的CpG DNA甲基化，以分析IL-4贬责/未贬责组Treg的甲基化景象。图表披露通过亚硫酸盐测序任性的DNA甲基化数目。

D. 采集Treg细胞、裂解，并用抗pSTAT6抗体免疫千里淀（IP）。通过免疫陈迹法分析IP卵白，使用抗DNMTs或抗pSTAT6抗体。

E. 使用抗DNMT1和抗pSTAT6抗体进行ChIP施行。通过及时PCR检测Foxp3启动子和CNS2的免疫千里淀DNA的相对量，并相对于IgG进行归一化。

F. Treg被转染HDAC2 siRNA或对照siRNA，并在体外用IL-2/TGFβ1培养4天，然后有或莫得高浓度IL-4刺激突出3天。代表性的流式细胞术和定量分析Foxp3+和CTLA-4+抒发。

G. 使用抗HDAC2和抗pSTAT6抗体进行ChIP施行。通过及时PCR检测Foxp3和CTLA-4启动子的免疫千里淀DNA的相对量，并相对于IgG进行归一化。每组n=3，三个重迭。

（3）高水平IL-4壅塞了CTLA-4介导的Treg对Th2细胞分化的扼制作用。

图3. 高水平IL-4壅塞了CTLA-4介导的Treg对Th2细胞分化的扼制作用，OTII小鼠脾脏均诀别的CTV记号的CD4+ CD25− Teffs和从BMDCs繁衍的DCs与Foxp3YFP/Cre或Il4rafl/fl Tregs以1:1:1的比例共培养2天。

A. CTV记号的Teffs数目和定量。

B. Teffs中IL-4抒发的代表性流式细胞术和定量分析。每组n=3，三个重迭。

（4）IL-4在AD小鼠模子中壅塞了Treg对Th2型炎症的扼制作用。

图4. IL-4壅塞了AD小鼠模子中Treg对Th2型炎症的扼制作用。

A. 第16天用酒精（EtOH）或MC903贬责的小鼠耳朵的代表性图像和组织学H&E染色截止。

B-C. 第16天从总计这个词耳朵和血液中IL-4+抒发的代表性流式细胞术和定量分析。

D-E. 第16天从总计这个词耳朵和血液中Foxp3+ CD25+ Treg和CTLA-4+抒发的代表性流式细胞术和定量分析。每组n=3只小鼠，三个重迭。

（5）达必妥(Dupilumab) 收复了重度AD患者的Treg数目和CTLA-4抒发，并扼制Th2型炎症。

图5. Dupilumab收复了重度AD患者的Treg数目和CTLA-4抒发过甚对Th2炎症的扼制作用。

A. 在不同时代点对AD患者外周血中Foxp3+ CD25+ Treg的代表性流式细胞术和定量分析。

B. CTLA-4+ Foxp3+ Treg的代表性流式细胞术和定量分析。

C. 在不同时代点对Th2细胞的代表性流式细胞术和定量分析。

易小结

Treg数目和AD的严重进度分级与血清IL-4水平接洽。相等高水平的IL-4表不雅遗传调控Treg数目和CTLA-4抒发减少。Treg中由IL-4指点的CTLA-4抒发减少壅塞了Th2细胞分化扼制。阻断Treg中的IL-4Rα信号不错收复Treg数目和对Th2型炎症的扼制，为AD诊疗提供了新的战略和深切的机制表面。

易基因：DNA甲基化磋议基本念念路

DNA甲基化一般死守四个设施：

率先，进行举座全基因组甲基化变化的分析，包括平均甲基化水平变化、甲基化水平漫衍变化、降维分析、聚类分析、接洽性分析等。

其次，进行甲基化各别水瓜分析，筛选具体各别基因，包括DMC/DMR/DMG任性、DMC/DMR在基因组元件上的漫衍、DMC/DMR的TF麇集分析、时序甲基化数据的分析战略、DMG的功能分析等。

再次，将甲基化组学&转录组学关联分析，包括Meta genes举座关联、DMG-DEG对应关联、集聚关联等。

临了，对筛选出的磋磨区域DNA甲基化进行考据，频繁吸收靶基因重亚硫酸盐测序（Target-BS）。

对于易基因靶基因DNA甲基化测序（Target-BS）

对磋磨基因/CpG 位点甲基化检测，成立活泼的靶向甲基化测序期间。易基因成立的靶基因甲基化高通量测序（Target Bisulfite sequencing，Target-BS）是针对已规画基因panel组合，欺诈易基因自主研发的甲基化特异性多重PCR引物遐想软件，对亚硫酸盐转念后的磋磨基因多重扩增，建库后进行超茂盛度（1000X以上）甲基化精确检测。

应用标的：

Target-BS等闲用于已知位点的甲基化Biomarker筛选、考据及临床转念应用

后续磋磨基因的甲基化考据

期间上风：

多基因多重扩增，检测通量高；超茂盛度亚硫酸盐甲基化测序，相对于传统BSP克隆测序，检测聪惠度、准确性高，可准确检测到样本中低于1%的甲基化水平；样本需求量低，20ng基因组DNA可达成多基因扩增；适用规模广，对基因组DNA、FFPE样本、游离cfDNA等样本均适用；检测用度显耀低于现存期间、快周期、超高性价比。

易基因提供全面的表不雅基因组学（DNA甲基化、DNA羟甲基化）和表不雅转录组学（m6A、m5C、m1A、m7G、ac4C）、染色质结构与功能组学期间决策（ChIP-seq、ATAC-seq），详询易基因：0755-28317900。

参考文件：

Wang B, Yu Z, Liu J, Tian Y, Ruan Y, Kong T, Hou M, Yu B, Ling S, Wang D, Chen Y, Xu Y, Deng W, Liang Y. IL-4-induced decrease in both the number and CTLA-4 expression of Treg impairs suppression of Th2 type inflammation in severe atopic dermatitis. J Dermatol Sci. 2024 Mar 23. pii: S0923-1811(24)00053-7. doi: 10.1016/j.jdermsci.2024.03.007. PubMed PMID: 38556434.

发布于：广东省